Кафедра інфекційних хвороб ЛДМУ ім. Д.Галицького

Публікації

ПАТЕНТИ

Герасун О.Б., Задорожний А.М., Зінчук О.М. Спосіб визначення сенсибілізації організму при інфекційних хворобах // Патент на корисну модель № 26600, 25 вересня 2007.

Корисна модель стосується медицини, зокрема клініки інфекційних хвороб, і може бути використана для визначення сенсибілізації організму до антигенів збудника.
При гострих і хронічних інфекційних хворобах спостерігається сенсибілізація до антигенів збудника, яка значною мірою визначає перебіг хвороби та її наслідки. Рівень сенсибілізації до антигенів збудника характеризує стан клітинного імунітету – підвищену чутливість сповільненого типу (ПЧСТ). Показники ПЧСТ у дослідах in vitro корелюють із результатами внутрішньошкірних діагностичних проб [1], а тому можуть використовуватись у тих випадках, коли діагностика in vivo із певних причин неможлива або небажана.

Відомим способом лабораторного дослідження сенсибілізації, який вибрано прототипом, є реакція специфічної бласттрансформації лімфоцитів (БТЛ). Реакція ґрунтується на здатності лімфоцитів периферичної крові у культурі лейкоцитів перетворюватися у клітини попередники – бласти під впливом антигену, до якого донора лейкоцитів сенсибілізовано у процесі хвороби або вакцинації [2]. Однак цей спосіб є складним, довготривалим (займає 6–7 днів). До того ж, на показники сенсибілізації значною мірою впливає функціональний стан клітин, зокрема можливе ушкодження (особливо при вірусних інфекціях) їх хромосомного апарату. Складним і недостатньо відтворюваним є облік результатів досліду – за інтенсивністю синтезу ДНК або за підрахунком клітин, що ідентифіковані як бласти. Морфологічні зміни лімфоцита, які є заключним етапом складного процесу трансформації, не завжди завершуються утворенням бластної форми.

В основу корисної моделі поставлене завдання створення простішого і краще відтворюваного, порівняно з реакцією бласттрансформації, способу, який дозволив би визначати сенсибілізацію організму до антигенів збудника, в тому числі на ранніх стадіях інфекційного процесу.

Поставлене завдання досягається тим, що у способі визначення сенсибілізації організму при інфекційних хворобах шляхом лабораторного дослідження культури лімфоцитів периферичної крові, згідно з корисною моделлю, сенсибілізацію організму визначають за синтезом фактору некрозу клітин α (ФНП-α) у культурі лейкоцитів, стимульованій рекомбінантним антигеном на твердій фазі, причому вміст ФНП-α у супернатанті визначається методом імуноферментного аналізу за допомогою комерційних тест-систем.
Перевага запропонованого способу полягає у тому, що він враховує початкові етапи трансформації – активізацію внутрішньоклітинних біохімічних процесів, з яких починається специфічна БТЛ, а саме синтез ФНП-α за його вмістом в супернатанті культивованих клітин. Синтез ФНП-α відбувається і у випадках незавершених морфологічних перетворень. Результати дослідження можна враховувати вже на 2–4 день культивування, тобто значно швидше, аніж за способом прототипа. Визначення вмісту ФНП-α методом імуноферментного аналізу (ІФА) за допомогою комерційної тест-системи спрощує облік результатів і дозволяє їх автоматизувати. Використання в якості специфічного стимулятора трансформації рекомбінантного антигену на твердій фазі, в тому числі комерційних тест-систем для ІФА, робить спосіб доступним для широкого впровадження в клінічну практику.

Спосіб здійснюють таким чином

Лейкоцитарну масу виділяють з гепаринізованої венозної крові (4000 од на 20 мл крові) шляхом відстоювання у силіконових пробірках під кутом 45˚ при температурі 37˚С протягом 60–80 хв. При сповільненій ШОЕ в окремих випадках попередньо проводять центрифугування при 100 g протягом 3-х хв. Лейкоцитарну масу обережно відсмоктують і двічі відмивають не менше, ніж у п’ятикратному об’ємі середовища № 199, центрифугуючи при 400 g протягом 5 хв. Осад ресуспензують у середовищі № 199 до кінцевої концентрації 4–5×106 клітин на 1 мл середовища. До культурального середовища додають пеніцилін та стрептоміцин по 100 од/мл.
Культуральне середовище з лейкоцитами переносять у флакони, до яких додають рекомбінантний антиген на твердій фазі. Попередньо його тричі відмивають 0,9 % розчином NaCl по 40 с. Культивування проводять в атмосфері СО2 при 37˚С протягом 48–72 годин. Для забезпечення нормального газообміну об'єм газу перевищує об'єм середовища у 8–10 разів.

Всі етапи дослідження виконуються стерильно. Підготовка посуду відповідає вимогам до посуду для культури тканин, основні етапи дослідження проводять у ламінарній шафі (боксі).

Клітини осаджують центрифугуванням, а у супернатанті визначають вміст ФНП-α методом ІФА. Для визначення ФНП-α у сироватці крові використовують комерційні тест-системи.

Для визначення вмісту ФНП-α за допомогою методу твердофазного ІФА використовують два типи моноклональних антитіл: один – іммобілізований на полістиролі (внутрішня поверхня лунок планшету для мікротитрації), другий – до незалежного епітопу молекул ФНП-α – знаходиться у вигляді кон’югату з біотином. Індикаторним компонентом є кон’югат пероксидази хрону зі стрептавідином, що споріднений до біотину. Після відповідної інкубації та промивання визначають активність зв’язаної пероксидази за допомогою субстрату методом фотометрії. Для обліку результатів, згідно з інструкцією виробника тест-систем, будують калібрувальну криву із використанням стандартних розчинів з відомим вмістом ФНП-α.

Клінічне спостереження за пацієнтами на хронічний гепатит В (n=62) засвідчило, що найвищий рівень сенсибілізації до антигенів HBV (HBeAg, HBcAg) спостерігався у хворих з інтегративною формою інфекційного процесу (>350 пг/мл у 85% хворих); у хворих з реплікацією HBV DNA показники ПЧСТ (за вмістом ФНП-α у супернатанті культури лейкоцитів) були нижчими (100–150 пкг/мл). У хворих з вірусологічною відповіддю на противірусну терапію спостерігався високий вміст ФНП-α (понад 1000–1500 пкг/мл), що зберігався до шести місяців після припинення реплікації, після чого починалося поступове зменшення інтенсивності синтезу ФНП-α.

У хворих на хронічний токсоплазмоз (n=11) реакція була позитивною у 100% спостережень, інтенсивність її корелювала з клінічним перебігом. Так, у хворих із такими клінічними проявами як ознаки діенцефального синдрому, артралгії, лімфоаденопатії (при наявності низького або помірного вмісту anti-toxo за відсутності у крові DNA токсоплазм за методом PCR) показники ПЧСТ, отримані запропонованим способом були статично вищими, ніж у пацієнтів з аналогічними титрами anti-toxo без клінічних проявів (відповідно вміст ФНП-α у сироватці крові становив ≤ 50 пкг/мл та > 100 пкг/мл).

Дослідження сенсибілізації до комплексу рекомбінантних антигенів різних геновидів борелій хворих на Лайм-бореліоз (n=10) свідчило про статистично вищі показники ПЧСТ у пацієнтів з безеритемними формами хвороби, а також при наявності ознак дисемінації (вторинна еритема, радикулонейропатії, артрити) порівняно з еритемними формами (відповідно < 50 пкг/мл та у межах 50–250 пкг/мл). Також було виявлено статистично вищі показники ПЧСТ у хворих на хронічні форми Лайм-бореліозу, особливо з ознаками резистентних до протимікробної терапії уражень опорно-рухового апарату.

Джерела інформації:

1. Якобісяк М.. Імунологія / Пер. з польс.; Під ред. В.В. Чоп’як. – Вінниця: Нова книга, 2004. – 672 с.
2. Иммунологические методы / Пер. с нем.; Под ред. Фримеля. – М.: Мир, 1979. – 518 с.